《分子生物学基本技术实验指导》共24个实验，分别介绍了组织或细胞总RNA制备和反转录、聚合酶链反应、实时荧光定量PCR、质粒重组与鉴定、淋巴细胞的分离等基因克隆技术，以及将所克隆基因进行转染后的蛋白质表达和转染细胞功能的检测等目前在生物医学研究中比较常用的实验方法。
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《分子生物学基本技术实验指导》主要供本科高年级及研究生学习使用，以强调分子生物学技术的应用性，同时也可作为青年科技工作者进行科研工作的参考书。
实验一组织或细胞总RNA制备和反转录
一、实验目的
1.掌握制备细胞或组织总RNA的原理和方法。
2.掌握RNA反转录为cDNA的原理和方法。
二、实验原理
总RNA提取试剂盒可从各种细胞或组织中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。裂解液中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层、中间层和有机层（下层），这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。整个操作可在1h内完成，提取的总RNA没有DNA和蛋白质的污染，可用于Northernblot、Dotblot、polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。
三、材料、试剂与仪器
1.材料
2.试剂
新鲜全血。
总RNA提取试剂盒（表1-1）、氯仿、RNA-freeddH2O、反转录试剂盒（表1-2）。
表1-1总RNA提取试剂盒内容
2分子生物学基本技术实验指导
续表
表1-4反转录引物的选择
图1-1阳性对照简图
3.仪器
低温台式高速离心机、低温冰箱、紫外检测仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、微量移液器吸头等。
4分子生物学基本技术实验指导
四、实验步骤
（一）总RNA提取
**次使用前应在去蛋白液RD、漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
（1）样品处理如下。
1）组织：将组织在液氮中磨碎。每50～100mg组织加1ml裂解液RZ，用刀浆仪进行刀浆处理。样品体积应不超过裂解液RZ体积的1/10。
2）单层培养细胞：直接在培养板中加入裂解液RZ裂解细胞，每10cm2面积加1ml裂解液RZ。用移液器吹打几次。
注意：裂解液RZ的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加入量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。
3）细胞悬液：离心取细胞，弃上清。每5×106～10×106动物细胞或植物细胞加入1ml裂解液RZ。加裂解液RZ前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
4）血液：直接取新鲜血液，加入3倍体积的裂解液RZ（推荐0.25ml血液＋0.75ml裂解液RZ），充分振荡混刀。
（2）将刀浆样品在15～30℃放置5min，使得核蛋白体完全分离。
（3）可选步骤：4℃，12000r/min离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
注意：如果样品中含有较多蛋白质、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可加此步骤离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。
（4）加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min。
（5）4℃，12000r/min离心10min，样品会分成3层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ的50%。把水相转移到新管中，进行下一步操作。
（6）缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混刀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃，12000r/min离心30s，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱CR3，可分两次转入，再4℃，12000r/min离心30s，弃掉收集管中的废液。
（7）向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD（使用前请先检查是否已加入乙醇），4℃，12000r/min离心30s，弃废液。
（8）向吸附柱CR3中加入700μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙
醇），室温静置2min，4℃，12000r/min离心30s，弃废液。
（9）向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12000r/min离心30s，去除残余液体。
（10）将吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000r/min离心2min，去除残余液体
（注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR3在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的反转录等实验操作）。
（11）将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加30～100μlRNase-freeddH2O，室温放置2min，4℃，12000r/min离心2min。洗脱缓冲液体积应不少于30μl，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在.70℃，以防降解。
注意：如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次，合并两次得到的溶液。
（二）反转录
合成的cDNA引物可结合实际情况从OligodT-AdaptorPrimer、Random9mers或特异性下游引物中任选一种。
（1）按表1-5配制反转录反应液。
（2）按以下条件进行反转录反应。
使用Random9mers进行反转录时，首先在30℃下保温10min，使Random9mers延伸达到足够长度，以便在42～55℃退火时与模板RNA充分结合。
五、RNA质量的判断
（一）完整性判断
通常使用琼脂糖凝胶电泳判断RNA的完整性。理论上，完整的RNA拥有28S∶18S=2.6∶1左右的比例（即相对分子质量之比）。由于大分子rRNA的二级及三级结构程度更高。较小分子的rRNA更容易降解，再加上RNA电泳受许多因素影响，包括电泳条件、上样量、被EB饱和的程度等，因此准确评估28S∶18S并不容易。另外，来自不同器官组织，在确定其mRNA没有降解的前提下，其比例也有区别（如肝和肺的比例较低）。可以说，2∶1是高质量的标准，但低于2∶1并不就是质量低。一般的，如果28S和18S条带清晰，且28S∶18S＞1，该完整性就可以满足绝大部分后续实验。如图1-2所示。
图1-21%琼脂糖RNA电泳图1～3.RNA样品，28S∶18S=2.6∶1
（二）纯度的判断
260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑
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